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翻译：华溶-唐伊浠
审核：华溶-段云剑
摘要
使用垂直扩散池的体外释放试验（IVRT）是一种评估局部剂型性能和更好地了解产品理化特性的成熟方法。垂直扩散池（VDC）是测量半固态产品的药物释放最常用的设备，已使用50多年；然而，这种技术往往受制于高变异性和不充分的再现性。各种方法参数影响药物释放和释放曲线的相关变化。本手稿的目的是检查VDC设备的关键参数和使用其开发的方法，并强调开发、验证和实施高效VDC方法时必须充分理解的。
一、简介
体外释放试验（IVRT）作为支持外用产品开发的工具已存在约50年。早期研究是以了解当时可用的传统类固醇乳膏和软膏的释放特性；Shah和其他人对氢化可的松和倍他米松二丙酸酯半固体产品进行了多次释放速率测定。还包括引入垂直扩散池（VDC）和术语“Franz”扩散池的创造。
VDC是开发和验证IVRT方法的最常用设备。还有其他可接受的系统，如浸没池和USP4，但这些系统不在本文的范围内。VDC通常由硼硅酸盐玻璃制成，并由两个隔室组成：供体室在实验过程中保存药物以及接收室是能够容纳合适体积的接收液并在实验过程中从接收池中部分或全部取出样品的部位。接收室设计为通过水夹层或干式加热源保持恒温。在供体室和接收室之间放置一个合适的惰性膜，该膜用作药物的固定表面，并介于在两个腔室之间的。目的在于保持药物和介质完全分离。美国药典第1724章更详细地描述了VDC，并根据工业界、学术界和监管机构领导的意见，推荐了仪器的具体尺寸。描述了各种尺寸，其中理解孔口直径、接收室体积和供体室大小是尽可能降低变异性的最关键因素。在过去20年中，各种出版社回顾了IVRT作为支持局部产品开发的工具的各个方面和应用，从非无菌半固体剂量表（SUPAC-SS）的放大和批准后变更到最近拟定的外用局部药物分类系统(TCS)。
1997年，发布了第一份关于IVRT使用的监管文件，以支持SUPAC-SS。该机构的指导文件允许使用IVRT代替临床试验，对商业产品进行某些改变。几个级别的变化，包括生产地点和规模的变更、生产工艺和设备的变更以及药品组成的成分的某些变化（例如，辅料等级或供应商以及单个辅料的数量），允许使用IVRT作为工具，以证明生产前和生产后批次之间的等效性，而不是临床试验。
因此最初的法规发布后，整个制药行业对开发IVRT方法的需求大幅增长，并开始成为局部用药产品开发项目的必要条件。监管机构对QbD作为局部用药产品开发的一部分期望也有所提高，这就产生了需要额外的工具来优化产品性能。因此，应用IVRT来了解释放机制的变化及成分和工艺参数的变化，可以更好地了解高质量局部产品的开发。
无论开发新药还是仿制药，开发与产品并行的IVRT方法可优化不同开发阶段的药物配方和生产工艺。药物中活性成分的释放特性可深入了解产品的微观结构，尤其是在长期稳定性研究期间，因此可在产品开发期间优化药物的物理特性。IVRT方法还可通过在临床评估过程中实施修改配方来建立一致性，从而为临床开发阶段之间的新药物的同一性提供支持。这些应用程序中的每一个是降低整个开发计划的风险所以都至关重要，并证明了在整个产品开发策略的早期实施这种性能测试是合理的。
在过去20年中，仿制药的监管批准显著增加；然而，局部外用仿制药的监管批准一直滞后。对于局部用药，在作用部位测量药物浓度通常是不可行的，血浆浓度少是生物等效性（BE）的良好指标。因此，建立BE的必需是进行临床终点研究，并且是批准在局部给药发挥其作用的品牌和非品牌仿制药品批准的实质性障碍。为了克服开发局部外用仿制药的障碍，美国食品药品监督管理局（FDA）实施了新策略。例如，当一个仿制药符合定性（Q1）和定量（Q2）相似性标准时，IVRT以及一些理化或药效动力学检测可用于证明微观结构（Q3）相似性，作为实施临床试验的替代方案。自2005年以来，已发布了几份生物利用度（BA）和BE指导文件。虽然首次发布的关于阿昔洛韦软膏的指南非常简短和笼统，但关于阿昔洛韦软膏、氨苯砜凝胶，和伊维菌素乳膏非常具体和详细，概述了高效液相色谱法（HPLC）和IVRT方法的开发和验证以及仿制药与参比产品的关键研究比较的要求。
二、方法验证
一旦为特定产品开发了合适的IVRT方法，应在产品开发期间的时间对其进行充分验证。过去20年的各种法规突出强调了使用VDC验证放行方法的方法。在上述FDA指导文件中，FDA最近从VDC开始详细描述了方法验证的监管期望。仪器应通过确认表面积、扩散池体积、温度控制和搅拌速率进行适当鉴定。在进行整套研究时，也应监测和维持适当的实验室环境控制。验证应包括对以下方法属性的适当评估:1）原料药在接收介质中的溶解度和稳定性;2)与膜结合的原料药;3)释放率的批内和批间精密度;4)释放速率的线性;5）恢复、质量平衡和剂量消耗;6)辨别敏感性;7）鉴别选择性;8)鉴别特异性;9)使用改变药物的补充鉴别选择性;10）最关键方法参数（例如，剂量体积、接收介质组成和pH值、搅拌速率、温度)相关的耐用性。上述各属性的具体描述在FDA的阿昔洛韦乳膏指导文件中找到。HPLC方法的验证建议与现行的美国食品药品监督管理局(FDA）生物分析方法验证指南或国际协调会议(ICH）分析方法验证协调三方指南Q2(R1)一致。尽管IVRT样品基质不像某些生物基质那样复杂，但通常预期生物分析方法验证原则，可能是因为IVRT被用于支持临床研究的生物等效性。
三、VDC方法参数
VDC方法有几个参数要达到最佳、可接受的性能必须严格控制。主要方法参数包括接收介质的温度、扩散池尺寸（例如，孔口直径、供体室尺寸和接受室体积）、采样时间、膜、接收介质、搅拌速率。适用于产品应用于供体室以及使用方法。在开发VDC方法期间，应适当选择每一个参数，并根据实验数据证明其合理性。仔细选择每个参数可导致开发的方法具有精密度、可重现性、对剂型中的各种变化具有区分性且适用于验证。另一方面，参数选择不当可能导致方法具有在实验内和实验间具有很高的变异性，从而难以从数据中得出充分结论。
前面提到的每个方法参数都将进行更详细地检查，然后讨论各方法参数如何影响使用VDC的IVRT方法的整体变异性。
3.1温度
膜表面接收介质的温度应严格控制，并根据使用部位进行合理调整。32±1℃对于大多数用于皮肤表面的产品是合适的，37℃±1℃更合适用于直肠或阴道应用的产品，在将药物应用至供体室之前和实验结束时，应测量各扩散池中的温度，以确认整个实验期间温度都在适当范围内。
3.2扩散池(VDC)尺寸
不同尺寸的扩散池可从多家供应商处购得。美国药典第1724章描述了常规的扩散池尺寸。如果使用VDC的其他尺寸，则应适当证明其合理性。在开发方法一种新方法之前，应仔细考虑扩散池的三个方面：供体室的尺寸、孔口直径和接收室的体积。首先，供体室的尺寸（即容积）会影响在实验期间维持渗透率不受剂量的影响的能力。如果活性成分迅速释放到接收室中，并且在实验期间使用的剂量被大部分释放到接收室中，则可能需要更大的供体室，同时增加的使用剂量以保持无限剂量。第二，孔口直径会影响药物渗透到接受池的百分比。通过使用较小的孔口直径可以将释放百分比降至最低。相反，通过使用更大的孔径可以增加释放量。第三，接收室的体积可用于增加或减少液体接收介质的容量，以确保在最终采样时间维持“漏槽”状态。接收介质越大，“水槽”就越大。扩散池的最佳尺寸是特定于产品的，并应使用实验数据进行适当论证。
作为VDC设计对药物释放影响的示例，图1显示了使用70:30的水：乙醇作为接收介质和Tuffryn作为渗透膜从氢化可的松乳膏中释放氢化可的松。使用两组不同尺寸的扩散池。较大的接收池具有约1ml体积，表面积1.767cm，而较小的接受池具有约8ml体积，表面积1.0cm。对于大池和小池，应用于供体室的乳膏量分别是大池400毫克和小池1g。尽管释放速率相似且相当，但大池的应用剂量释放百分比为12%，而小池仅为2.5%；随着施用量的增加和孔口的越小，释放率的百分比越低。虽然在这种情况下，释放速率没有显著变化，但不同的池体尺寸可能导致相同药物和相同VDC方法的释放速率大相径庭。
3.3取样时间和步骤
通常在4-6小时内进行取样，每个扩散池至少取5个点。该持续时间在实验上是可行的，当其他方法参数合适时，通常可以在该时间范围内实现线性释放区域的识别。采样时间的选择应与药物的释放量和时间的平方根呈线性。当抽取一定量的接收介质时，应立即同时更换等量预热的介质体积，以便在整个实验过程中膜的下表面与接收介质保持接触。样品应从适当混合的扩散池体中间位置抽取。
3.4合成膜
该合成膜在实验过程中用作药物的惰性保持表面。膜将覆盖供体室与接收室之间的交叉处，孔口本身是将确定药物的可用表面积，而不是膜。在IVRT实验中，有多种市售合成膜可使用（例如PTFE（聚乙烯四氟乙烯）、PVDF（聚偏二氟乙烯）、聚碳酸酯、聚砜、聚醚砜、尼龙和纤维素）。这些膜有不同的孔径和直径都可以从供应商处购买。
合成膜不应成为药物释放的限速因素，不应与产品中原料药结合或对分析测定产生任何干扰。合成膜应与药物和所选接收液具有良好的相容性。
3.5接收液
在IVRT方法开发期间，接受液可能是最关键的参数选择。接受液应具有较高溶解药物的能力，以确保在整个实验过程中保持漏槽条件（即活性成分的释放速率不应受药物在接收液中溶解度的限制，并且活性成分在接收池中的溶解度是在最终时间点所取样品浓度的5至10倍）。不符合漏槽条件的方法不能应用于得出有关药品性能的结论。所选溶剂还应与膜以及样品分析的分析方法兼容。活性成分在接收液中应足够稳定，以支持在适当温度下进行实验，在必要时支持再次进样的分析时间或需要采集后储存期间，都生成数据的稳定性。此外，接收液应提供线性和精确的释放速率在单个实验，足够的释放率从一个实验到另一个实验，从一个科学家到另一个科学家的释放速率的充分重现性，以及在FDA阿昔洛韦乳膏指导文件中所述对有意改变的药物之间的区分。
3.6搅拌速度
所有扩散池的搅拌速率应一致。许多市售扩散池系统的转速为600转/分，但如果能证明在整个实验期间实现接收液能够充分混合，则可证明其他速度也可以采用。
3.7上样量
通常，将不少于300毫克的药物上样到供体室，其通常足以完全覆盖膜的表面。实验期间，药物的释放动力学应符合Higuchi假设的无限剂量要求，以确保方法的最佳性能。一般而言，在实验期间，不超过30%的所用药物应释放至接收液中，以确保在供体室中保持无限剂量；因此，大于300毫克的剂量是合理的，以确保在整个实验中保持无限剂量。如果药物完全覆盖膜的表面，并且在实验的最终采样点的供体室中保持无限剂量，则小于300毫克的量也是合理的。当供体室中药物的量成为速率限制时，允许释放超过应用剂量的30%可导致释放曲线的非线性。释放曲线的斜率将下降，导致出现释放饱和。线性不足可能导致释放率数据的变异性，并影响数据的总体质量；因此，建议采用30%释放临界值，以确保数据精确且重现性。
3.8应用方法
由于有多种可接受的VDC设计，因此将剂型输送至供体室的方法可能有所不同。此外，剂型本身的物理性质（例如粘度）可能是如何将药物最好递送至供体室的一个因素。已经实施各种方法，包括使用金属刮刀将剂型铺到聚四氟乙烯晶片中间，使用不同体积的注射器，并将产品直接倒在膜的表面上。这方法应该最低限度地影响剂型的流变性，并且具有重现性，以使释放速率不受应用方法的影响。
四、方法的常见变异性来源
与任何分析方法一样，IVRT方法和计算释放速率具有一定的可变性。IVRT方法的某些方面需要大量的人为人为干预（例如，样品制备、将产品应用于供体室、采样），这比其他成熟的分析方法具有更高程度的可变性。许多已发表文献描述了相关的可变性，包括原始SUPAC指导文件，强调了从根本上了解这种可变性的来源以及如何更好地控制它的重要性。在IVRT实验中经常观察到变异性，有几个输出；理解IVRT数据的表达方式是理解和识别潜在误差来源的关键。一般而言，通过IVRT方法可观察到三种不同类型的变异性，称为“池体内变异性”、“实验内变异性”和“日常变异性”。
释放率曲线是根据单位面积活性成分累积释放量与时间平方根的函数（即释放速率的线性关系）线性回归生成的数据（图1）；因此，释放速率是基于扩散池内给定时间段至少5个点计算的。单个扩散池体内样品浓度的变异性可能导致较差的线性关系，这可描述为“池体内变异性”，因为它发生在单个扩散池内。释放速率的线性关系应在单个池体内> 0.90，以尽量减少多个池体之间的变异性。
典型实验方案包括给定药物进行6次重复，以计算平均释放速率。在这6份重复样品中，变异系数理想地应为≤ 15%（释放实验，华溶客户一般期望为5%），以便得出有意义的结论；尽管变异性可能高达20%，但根据作者的经验，仍认为足够精确。这种类型的变异性可描述为“实验内变异性”，因为它是根据单个实验中多个扩散池的释放速率计算的。
单个产品的释放速率实验可以是由多名科学家在多天内进行。较差的耐用性方法可以表示两次实验之间的时间变化；这种变异性可描述为“日常变异性”。在稳定性项目中，对于单一产品在多天内进行的释放率实验示例是来自初始数据点（T=0）的释放率数据可与在指定储存条件下延长一段时间后生成的后续数据点（例如，T=3个月）进行比较。在不同时间由不同科学家进行实验时，VDC方法必须具有重现性。
为了始终最小化可变性并生成精确且具有重现性的数据，必须考虑实验方案中的影响因素，并确定通过改进技术和实施实验室控制的最小化因素。在一个给定实验中，有许多潜在的变异性来源，包括剂型本身、适当选择兼容的VDC设计、样品制备、样品应用方法、取样技术和接受液的组成。这些因素中的每一个都将被更详细地讨论。
药物剂型和物理性质某些剂量剂型的物理性质可能比其他剂型更容易发生变异性。物理性质可能影响药物从剂型基质中的释放速率，并有助于与开发的IVRT方法相关的变异性。剂量的类型和剂型的复杂性将导致在释放率曲线中观察到的变异性程度（制剂可能导致的释放实验的高变异性）。具有多相的剂型（例如，面霜和乳液）比单相剂量剂型（例如，凝胶）更复杂；剂量形式的复杂性使得变异性难以控制。活性成分在从剂量中完全释放之前可能需要在制剂内通过多个阶段完全释放进入接收室和接收液。此外，多相剂量形式通常对剪切应力更敏感，其物理稳定性可能在样品制备期间或样品应用至供体室间受到影响。
同样，含有溶液中药物百分比和混悬液中药物百分比的剂型是更复杂的剂型的另一个示例，具有增加固有变异性的趋势。活性成分可能需要在剂型在完全释放到接收液之前或在接收液的界面处。
例如，内部研究表明，极性药物（如阿昔洛韦）在软膏混悬液中存在时，其释放曲线通常具有很高变异性，而乳膏制剂的变异性可能更易于控制。类似地，对于存在多种剂量形式（洗剂、乳膏和软膏）的药物（如地奈德），释放曲线的内在变异性因每种剂型的复杂程度而异。
4.1VDC供体室
美国药典第1724章描述了两种不同的供体室设计。第一个模型使用聚四氟乙烯晶片制造供体室，将产品放置在合成膜顶部。晶圆片通常是高度为1.5毫米，直径为15毫米，市面上也有其他尺寸。在晶圆片顶部组装支撑盘，使用夹具将供体室固定至接收室之前将产品封闭。在该模型中，晶圆片定义了产品接触膜的表面积，在将晶圆片和圆盘完全固定到接收室之前，将产品应用于到供体室。
第二个模型使用磨砂玻璃供体室组合磨砂玻璃接收室来创建两个腔室之间的界面。两个腔室中的孔具有匹配的直径，通常为11.28或15毫米，因此限定了产品接触膜和接收液的表面积。在该模型中，将供体腔完全固定至接收腔后，将产品应用至供体腔。该模型中的供给室通常为18毫米高度，约为标准晶圆的10倍。
在这两种类型的供体室之间存在三个重要的差异需要注意。因为聚四氟乙烯晶圆模型在膜下方没有相应的表面来为药物提供支持，所以晶圆模型可能不适合低粘度或流动的制剂。使用具有低粘度制剂的该模型可能导致制剂渗漏至晶圆孔形成的规定表面积外，在药物产品暴露于接收液中产生变异性，可能导致“池体内变异性”。如果暴露的表面积从一个扩散池到下一个扩散池是是不同的，释放速率的变异性也可能在实验中增加。磨砂玻璃模型适用于低粘度制剂，甚至与液体制剂兼容，因为磨砂玻璃接头提供了足够的界面以防止泄漏。
其次，使用聚四氟乙烯晶片时，供体室的容量因高度降低而受到限制。当使用标准尺寸晶片时，供体室的容量约为200-400毫克药物，而无晶片的供体室的容量是5-10倍。
需要注意的最后一个不同点是供体室完全固定至接收室上的点。使用磨砂玻璃模型时，在将产品应用到扩散池之前，将腔室固定在一起，减少了对膜表面的接触，并使将药物轻轻输送到膜表面更具挑战性。由于减少了使用的方法，因此该模型应用程序方法例子受到了限制。对于某些药物，样品使用方法可改变产品的物理特性，并导致池体内和实验内变异性。
4.2样品制备及上样方法
如果操作不当，样品制备技术和应用方法可能导致很大的变化。样品制备是指用于从包装（即管、泵、瓶）中收集药物的方法，应用方法是指药物如何应用于供体室。从剂型中收集足够药物的方法应简单、一致，并对药品施加最小剪切应力。剪切应力可在复杂的剂量形式（如洗剂和霜剂）中产生物理不稳定性；药物内产生的变化可导致池体内变异性和实验内变异性，因为药物在给药后在供体室中发生变化。在某些情况下，在给药前对药物进行细微的操作或混合可能是必要的，但应适当证明合理。
同样，应用技术应简单、一致，并对药品施加最小剪切应力。有两种典型的方法：用抹刀铺开和用注射器注射。使用的方法通常取决于两个因素：扩散池供体室类型和剂型的物理性质。如前所述，某些VDC需要使用聚四氟乙烯晶圆片，而其他VDC则不需要。使用聚四氟乙烯晶圆的模型需要更接近膜的表面，这使得配方可以用金属刮刀轻轻涂抹铺展，降低了复杂药物的变异性，如果使用注射器输送至供体室，则对施加至药物上的剪切应力敏感。因此，当使用抹刀摊铺的技术将药物应用于供体室时，复杂药物的释放速率通常会降低变异性。例如，表1展示了使用单相和多相配方的两种不同应用技术的释放率变异性比较。释放速率的精密度取决于两相产品的应用技术。在上药过程中最大限度地减少剪切力，可提高释放速率的精密度和重现性。剪切对变异性的影响取决于剂型，因为更复杂的药物会受到影响，而单相产品没有。此外，图2展示了使用每种应用技术的1%乳膏制剂中氢化可的松的释放率数据。当该产品是使用抹刀涂抹产品时，与使用注射器涂抹产品相比，释放速率的变异性较小。
制剂应平稳、均匀地涂敷在膜上，涂抹后不得与膜明显分离。分离过程将在膜和药物之间的界面处形成气泡。接触间隙的影响可对数据产生与接收液中的气泡类似的影响。变异性可表示为池体内或实验内变异性。一些产品（如疏水性软膏）与使用注射器输送相比，在扩散期间形成气泡的趋势增加。药物与膜的物理相容性将对药品间隙的形成有显著影响。
4.3取样补液方式
取样技术是方法的关键组成部分，如果执行不当，可能会导致数据变异性。正确的取样方法因扩散池的制造商而异；一般在美国药典第1724章有描述。样品应始终从膜表面下方的扩散池中心取出。应注意确保样品不靠近扩散池的臂部，因为与扩散池中心相比，臂底部的混合是最小的。取样过于靠近扩散池的臂可能导致样品浓度较低和活性成分释放速率明显非线性。如果取样程序不是使用校准的移液管进行的，则应对该程序进行适当验证，以证明其不会导致池体内或实验内变异性。
取样后或取样过程中，重要的是用等量的预加热的接收液替换取样的体积，以在实验期间保持恒定体积。在取样和更换过程中，避免将任何气泡引入接收室至关重要。气泡会上升至接收液与惰性膜之间的界面，从而减少药物释放的可用表面积。这种减少的表面积可导致释放速率的降低，并导致池体内变异性。
4.4接受液的组分
在任何IVRT方法中，接收液的组成可能是最关键的参数。接收液的组成应与药物和惰性膜相容，活性成分应在可用的体积内充分溶解并且应有良好的区分灵敏度。在方法开发和验证期间，应在耐用性实验期间评估释放速率对接收液组成的灵敏性。应评估组分比例、pH值、离子强度和任何其他相关变化。使用改变的组合物的活性成分的释放速率应直接与使用原始方法条件的活性成分的释放速率进行比较。耐用性不足的方法（即，当改变的条件不符合SUPAC指南中所述的统计检验的“相同”标准时）在实验间会导致出现重现性较差。
不同时间、实验室或科学家之间的变异性（即日常变异性）。图3显示了一个实例，其中活性成分的释放速率对接收液中存在的有机溶剂的量高度敏感。适度调整有机溶剂的量（~ 5%）导致活性成分的释放速率存在显著差异。在此情况下，向接收液中添加少量额外有机溶剂可使释放速率翻倍。像这样的灵敏度将使比较不同的科学家使用不同的接收液制剂在不同的日子产生的释放率变得困难。高度控制的技术和对接收液制备的严格限制可以最大限度地减少高敏感接收液的影响(即，使用容积玻璃器皿和在使用当天制备接收液)。
4.5接受液的脱气
一个非常常见的变异性来源是接收液脱气和接收室中气泡引起的。接收液脱气是在很普遍含有水和有机成分混合物的接收液中。在IVRT实验期间，含有表面活性剂的接收液会形成气泡，仅在必要时使用，以实现活性成分的充分溶解。这些气泡可在聚集膜和接收液之间的界面，从而减小可用于药物释放的表面积。表面积减少可导致释放速率降低，并导致数据变异性。如果在实验期间观察到气泡，则可通过小心倒置池体以通过开放取样臂去除气泡。根据何时气泡被发现，变异性可表示为非线性的“池体内”，或表示为离开池体的“实验内”。防止实验过程中形成的气泡可以在使用前接收液进行脱气。
五、结论
在IVRT数据中观察到的总体变异性有几个因素。当前用于进行IVRT研究的设备需要大量的人力参与，特别是在样品应用和取样期间，使数据容易受到实验误差的影响。实施严格的实验室控制和实验方案，以及使用适当合格和验证的VDC系统，可以减少较高变异性的可能性。随着IVRT方法继续发展为监管预期，标准化设备和增强的自动化将继续观察变异性，并改善实验结果。
六、参考文献
略
