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翻译：华溶-梁忠均
审核：华溶-段云剑
一、摘要
采用四种溶出方法：篮法、桨法、透析管法（DT）和流池法（FTC），研究了含对乙酰氨基酚（AAP）的亲脂性栓剂的释放特性。使用统计程序评价AAP复合栓剂中各质量控制装置的适用性。在所有研究的释放方法中，超过80%的药物在60分钟内释放，篮法除外。在100和200rpm的转速下使用桨法实现了可重复且较快的释放，而篮法的释放较差。平均溶出时间（MDT）、取样时间结束时AAP的最大溶出量（Q）和溶出效率（DE）采用模型无关法计算。本研究中使用的单腔FTC法也适用于AAP栓剂（质量分数100%，MDT 71-91分钟，DE75-80%）。从质量控制角度来看，DT装置与FTC装置相似，用于判断含AAP的亲脂性基质栓的释放特性。然而，即使本研究中使用的单腔FTC也有可能作为栓剂的体外药物释放试验。比较溶出度法有望成为选择合适溶出度试验的有价值工具之一。
二、介绍
体外释放/溶出试验被广泛认为是确保新型剂型批次间均匀性的质量控制程序，也是体内吸收的预测工具。已发表了几种检测栓剂体外释放的方法；然而，直到最近，它们都没有被推荐为标准方法。栓剂的释放试验通常使用桨法和篮法进行。流池法（FTC）也被视为替代方法。此外，对透析管（DT）方法的修改导致其被视为栓剂的体外药物释放试验。JP17对栓剂的定义是：“它具有适当的药物释放特性”。因此，需要进行适当的测试，以证明活性物质从栓剂中的适当释放。但是，JP17中未对栓剂的释放/溶出方法进行标准化或描述。
博士Eur和英国石油公司推出了一种用于栓剂的流池法溶出仪器（推荐使用华溶DS-7CP流池法溶出系统），其无膜系统由两个相邻腔室（双腔室FTC）组成。通过测试和评估溶解性极弱的不同剂型和活性药物成分，流池法（FTC）方法的优势显而易见。然而，对于药物释放和栓剂释放率的单一检测，仍可采用官方溶出方法。我们配备12 mm单测试池和活塞泵的流通池装置（图1)。它提供了评估口服剂型释放的优势，如缓释制剂。迄今为止，很少有研究评估栓剂溶出装置的适用性
任何单一检测方法均不适用于所有栓剂制剂。因此，在亲水性栓剂的情况下，从篮法或桨法开始，以及在亲脂性栓剂的改良FTC法开始可能是有利的。还可以选择DT法作为考虑直肠液体容量的筛查工具之一。需要为任何栓剂选择一种或两种适当的体外释放试验，无论其是否具有亲水性或亲脂性碱。需要对栓剂进行更稳健的体外释放/溶出试验，以避免根据具体情况采用不同的技术。
本研究的目的是研究适用于含油基质栓剂的体外比较溶出度方法。采用篮法、桨法、DT法和FTC法，研究了模型药物对乙酰氨基酚栓剂的释放速率和重现性。通过检查体外释放曲线以及栓剂释放的模型独立参数，评估四种方法的重现性。在本研究中，选择了一种在日本市售的AAP栓剂作为试验栓剂，该栓剂具有体内生物利用度数据。AAP在以适当剂量使用时，在国际临床上通常被视为儿童唯一安全有效的药物。因此，许多在临床领域开发和使用了通用栓剂产品。Kuroda等人表示担心，使用互换DT法时，某些产品可能在溶解度、起效时间和作用持续时间方面存在差异。因此，本文采用比较溶出法对AAP栓剂进行质量控制。本研究程序可能是一种评估仪器选择和分析栓剂药物释放特性的有效方法。我们的最终目标是提出一种通用的栓剂体外释放方法，且该方法能够预测批次间差异和产品质量。
三、体外溶出技术
3.1 篮法
根据JP17篮法，使用自动溶出仪（推荐使用华溶DS-1206AT全自动取样溶出系统）对具有40个网篮的栓剂进行体外释放研究。使用根据上述化学品章节制备的900ml磷酸盐缓冲液（pH 7.2）作为溶出介质。在37.0±0.5℃的温度下进行六次试验，转速分别为50、100和200rpm。内部底部之间的距离试验期间，容器和篮子保持在25 mm。在360分钟内使用过滤探针定期采集连续样品，并用等体积空白培养基代替。使用HPLC对AAP进行定量分析。
3.2 桨法
桨法在与篮法相同的条件下进行。根据JP17桨法，使用自动溶出仪（推荐使用华溶DS-1206AT全自动取样溶出系统）进行栓剂中药物的体外溶出。该仪器由一个溶解容器和一个由轴（直径9.5mm）形成的搅拌器元件组成，溶解介质保持在37±0.5℃（900 mL 50 mM磷酸盐缓冲液，pH7.2）。搅拌元件的轴和桨部件由不锈钢制成。释放率在六小时内，以50、100和200rpm的转速测量栓剂的AAP。试验期间，容器内部底部与桨叶之间的距离保持在25 mm。取样时间分别为5、10、20、30、40、50、60、100、120、180和360min，在每个取样时间点抽取的体积约为5 ml。样品通过0.2μm过滤器过滤，然后通过HPLC进行分析。进行了六次重复实验。
3.3 FTC法
使用的FTC类似于配有活塞泵的自动溶出装置（图1)。将900 mL 50mL磷酸盐缓冲溶液（pH 7.2）置于2L烧瓶中，设计开放式系统。烧瓶在水浴中保持37.0±0.5℃的温度。池体内径12 mm，5 mm的红宝石珠子置于池体底部，并将小玻璃珠（玻璃珠直径，0.105-0.125mm）。将栓剂置于池体中，为了评估栓剂的药物释放，设置三个流速（4、8和16ml/min），本测试使用六种栓剂进行。通过池体的部分溶出介质在360min内定期回收，使用直径为0.5mm的硅胶管输送溶出介质。
3.4 DT法
Tanabe等人的方法，（透析膜，孔径：25-50mm）用于测量栓剂的药物释放。将栓剂放入DT中，挂在支架组件上，必要时将测试液加入DT。DT在两侧用闭合件以5 cm间隔垂直固定。将DT浸入容器（900 mL）中，并通过搅拌桨在50、100和200rpm下搅拌。在与上述桨法相同的条件下使用搅拌装置和恒温装置。将三个体积的pH 7.2的磷酸盐缓冲液（0，3，6 ml）作为内部缓冲溶液放入DT中。药物释放的分析方法如下所述。
3.5 AAP分析
通过HPLC分析所收集的溶出介质组分中的AAP浓度。HPLC系统由配备SPD-20 AV UV检测器的岛津LC-10系统组成。在C-18反相柱（150 ×4.6 mm i.d.；粒径= 5µm）用以下洗脱剂以1.0 ml/min洗脱，柱温为40℃。用含有0.1%磷酸盐缓冲液-乙腈（95:5 v/v）的流动相以1.0 ml/min的流速洗脱AAP，并在242 nm处进行紫外检测。
3.6 数据分析
给出了6次操作释放值的变异性、平均值、标准差（SD）和变异系数（CV）的比较。不同溶出方法的总体再现性估计为累积变异系数（CV面积）。参数CV面积定义为上SD溶解曲线下面积与直至时间T的平均溶解曲线下面积的百分比。曲线下面积均使用梯形法则计算。通过以下参数评估释放过程：平均溶解时间（MDT）、溶解效率（DE）和最大溶解量（Q）。用Excel计算了所研究的释放参数（MDT和DE）。在每次实验结束时测量Q值。还使用EXCEL统计软件进行数据分析。采用Tukey's和Dunnett检验评估两种方法方差比之间差异的显著性。对于p值小于或等于0.05的结果，声明了显著性。
四、结果
4.1 篮法
图2a显示了使用篮法从栓剂中释放AAP的情况。在50rpm、100rpm和200rpm条件下，磷酸盐缓冲溶液在6h内释放的百分比分别约为6%和56%。在表1中，平均MDT、DE和Q值与溶出介质中六次重复样品的参数各自的标准偏差一同出现。当使用篮法时，AAP显示有限的DE（4.8-44.2%），并且由于释放量和再现性差，无法准确计算MDT。从AAP释放的参数所得结果，统计分析显示（Tukey检验）篮法和任何其他检验方法之间释放的Q和DE存在显著差异（p < 0.05）。如图3所示，只有篮法得出的CV面积> 20%。由于采样时间不同，因此可将CV面积（%）视为体外溶出度方法总体重现性的近似指标。表2显示了使用这四种方法的亲脂性栓剂在不同时间溶解的药物百分比的变异系数。除了最初的5min，变异系数大约是原来的3-50倍，取决于时间。
4.2 桨法与任何其他测试方法相比，桨叶法在所有转速下的释放曲线都更快（图2b）。在50rpm时，AAP的释放比在100或200 rpm时慢。转速为100和200rpm时的桨法显示出短MDT，在转速为50rpm时的MDT中观察到显著差异（P < 0.05，Dunnett检验）。虽然桨法显示出非常快的释放，但它也实现了可重复的结果，除了50 rpm的结果（图3和表2）。采用桨法的DE和Q分别约为89-10%和97.8-102.5%，并且该方法在任何测试的转速下都能获得满意的药物释放。
4.3 FTC法
无论流速是4 ml/min、8 ml/min还是16 ml/min，FTC法3 h内栓剂释放的平均AAP量约为95%。FTC法的药物释放明显慢于桨法（图2c）。使用FTC方法时，AAP的MDT为70.9-91.3 min。然而，采用FTC方法的DE和Q分别约为74.7-80.3%和100.4-101.8%。观察到不同仪器之间的变异系数存在显著差异。在初始释放阶段，桨式或篮式方法的变化较大，而FTC方法的变化较小（图3和表2）。
4.4 DT法
如图2d所示，无论DT中的内部缓冲器的转速和体积如何，DT方法在6 h内几乎完全释放；然而，发现使用DT方法从栓剂中释放AAP的速度较慢（图2d）,延长释放率。此外，AAP的MDT为84.6-101.8 min，而DE和Q分别为72.4-77.9%和99.7-102.2%。DT法的模型无关参数与FTC法相似。然而，在整个范围内发现了显著的变异性，从试验初始阶段到120min，DT法给出的变异系数大于10%。
五、讨论
为了阐明AAP栓剂的释放特性，根据释放结果计算了模型无关参数MDT、Q和DE。结果表明，使用的溶出仪器类型影响栓剂中AAP的“体外”释放速率。硬脂肪栓剂AAP释放曲线的比较（m.p.33.5-35.5℃）表明，桨法在100和200rpm下的AAP释放速率非常快，这归因于“更强”的搅动条件。AAP的释放过程不能反映AAP的水溶性；其释放可能更依赖于扩散模式和与溶出介质的有效接触面积。因此温和的搅拌条件，即50-75rpm，通常建议在溶出实验阶段用于快速释放的口服固体制剂，以便使用桨法获得最大鉴别能力。在搅拌速率方面，在50rpm和桨法测试的任何其他速度之间，观察到MDT存在显著差异。本研究获得的结果与先前的研究结果基本一致。然而，篮法的结果不同；栓剂中AAP的释放较差。因此，任何搅拌速率下的篮法都会导致不完全Q和无关MDT (MDT对于篮法，未进行测量）。栓剂基质似乎对药物释放至关重要，如果脂肪通过篮网渗漏，这种方法可能导致AAP在测试过程中更快地完全释放。熔化的团状物很可能保留在篮网内，大量释放的AAP被熔化的团状物所覆盖。先前使用含aspirin10的市售栓剂报告了不符合要求的释放曲线。DT法得出的释放曲线几乎一致，与搅拌速率（200rpm）和内部缓冲液量（0-6ml）无关，与桨法相比，DT法从熔体中释放药物的速度更慢。在生理条件下，从栓剂中释放的药物以小体积（3-5 ml）的直肠分泌物进入溶液。先前报告的成人和儿童直肠pH分别为6.8-7.9和7.2-12.1，因此，我们选择了由两个水相组成的37℃下pH7.2的磷酸盐缓冲液。膜的优点是在取样部位提供过滤的澄清溶液，以便立即进行分析。另一方面，膜的存在将显著降低运输过程的整体动力学速度。膜渗透可能成为一个限速步骤，然后几乎完全“隐藏”释放动力学，它引入了一个人工运输过程因此一般不推荐。
FTC方法导致AAP的释放曲线较慢，这可以通过熔体的不同扩散条件来解释。此外，体外释放表明，将流速从4ml/min增加到16ml/min不会显著影响MDT。最可能的解释是，由于AAP的溶解度较高（在37℃下，在pH 7.4磷酸盐缓冲液中为16.8 mg/ml），AAP的释放过程不受FTC方法中不同搅拌速度的影响。先前的研究表明，这三种方法（桨法、篮法和FTC）为亲脂性栓剂的AAP提供了几乎一致的图谱。本研究中使用的硬脂肪栓剂并非如此。影响栓剂释药的因素有：组成、熔融行为、流变行为、药物浓度、药物粒度、药物溶解度。组成类型是造成这种差异的最可能原因。体外溶出试验结果表明，AAP与硬脂肪的比例影响释放速率。当药物含量增加时，传播能力就会降低。使用FTC方法时，这种成分差异的结果可能是熔体和溶出介质之间的接触面积较小。因此，通过熔体到脂肪和介质之间的界面的扩散过程几乎是限速步骤。
改良的FTC被认为是亲脂性栓剂的适当测试设备。栓剂池包含两个连续腔室。然而，我们研究中使用的池体仅包含一个与过滤头直接连接的腔室。正如预期的那样，由于两种池体类型的设计不同，水动力条件也有所不同。然而，发现使用一个腔的FTC方法能够充分区分AAP栓剂的释放曲线。Gjellan和Graffner报告称，使用22.6mm单腔细胞的FTC方法（主要针对口服剂型开发）产生的释放曲线与采用统计矩分析和卷积法时获得的AAP血浆浓度曲线一致。因此，具有单腔的池体有可能成为检测药物释放和栓剂释放速率的官方溶出设备之一。
本研究的目的是检验不同溶出方法的重现性，并对其对待测产品的适用性进行评估。在6次操作中，桨叶法在50 rpm下的方差略大于FTC和DT法。篮子中的非典型变异模式值得注意。早期采样时间点的变异系数值较低，而研究结束时注意到持续增加（表2），由于FTC方法的初始变异系数小于10%，因此判定熔融栓剂试验方法的重现性合格。尽管先前使用FTC药典获得的结果表明其可能产生高度可变的数据，但我们的结果并未显示AAP从熔体释放的较大变化。由于总试验时间较长，我们发现FTC方法适用于AAP的质量控制。
虽然AAP从直肠吸收良好，但其吸收速率比口服给药的吸收速率慢。口服和直肠吸收后生物利用度相同。AAP栓剂的吸收比灌肠剂慢：粒径越小，栓剂体积越大，药物的吸收越快。因此，栓剂系统的组成和配制药物的溶解度显著影响四种体外溶出方法的溶出行为。在FTC、桨叶（50 rpm）和DT方法中没有指出一种明显优选的方法。在研究AAP熔融栓剂的体外释放特性时，由于数据的重现性和一致性，FTC仪器可能是更好的方法。此外，FTC装置比浆法更少依赖强烈的流体动力学。FTC溶出试验有可能成为栓剂生物药剂学特性的有用预测因子，并确保产品（批次）质量在规定的一组规范标准内。作为一个额外的优势，先前的研究证明使用FTC溶出度的体外/体内相关性良好。为了显示体外和体内数据的等级顺序，试图绘制DE参数（%）与体内数据的关系图。Lauroba等人提出，一种半合成甘油酯栓剂，在20ml/min的流速下，DE=89%，提高了AAP的生物利用度。我们研究中使用的栓剂在16 ml/min的流速下的DE为80%。根据剂量归一化AUC的比值计算，其相对于先前报告的溶液的相对生物利用度估计为充足的（Frel ≤ 1）。此外，使用统计矩参数的相关性研究如MDT可能适用于栓剂。Anderson等使用非线性混合效应模型（NONMEM）估算直肠给药后单室模型的药代动力学参数。新生儿和婴儿直肠AAP溶液的吸收半衰期参数为0.33h。甘油三酸酯碱栓的吸收半衰期为0.80 h。假设单室开放模型充分描述了AAP的血浆浓度数据，我们尝试使用它们的参数估计体内MDT。MDTin体内用于甘油三酯基础栓剂估计约为40 min。本研究中使用的硬脂肪栓剂的MDT约为70 min。虽然没有达到1:1的关系，但我们的实验体外参数似乎接近体内参数。然而，需要在体内人体研究中得出关于本产品生物利用度的明确结论。虽然不可能为药物释放特性研究设计单一的测试系统，但FTC方法可用作产品开发早期阶段的第一种方法。
六、结论
本文试图用四种溶出方法比较栓剂的药物释放，使用独立于模型的参数评估释放过程。四种仪器中含有AAP的亲脂性熔化栓的释放行为表明了FTC方法的优点。本研究结果支持先前的研究结果，即FTC法是用于溶出试验的烧杯法的合适替代方法。我们的研究程序是一种评估栓剂药物释放特性的仪器适用性的有效方法。此外，本研究中使用的所有设备均可在商业上获得；不限于专业实验室。因此，我们打算进行额外的研究，以比较本研究中使用的参比产品的释行特性。目前正在对栓剂中各种溶解度的基质和药物的影响进行比较研究。
七、参考文献
